产品名称:Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒
产品特点:Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒的相关产品:CRF (Corticotropin-Releasing Factor 0.5mgCRF (Corticotropin-Releasing Factor) 促肾上腺皮质激素释放因子IL17RC Protein Human 重组人 IL17RC 蛋白 (aa 1-454, His 标签)
产品型号:
更新日期:2024-11-19
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Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒的详细资料:
产品仅供研究使用,不适用于人类或临床诊断
商品属性:
产品英文名称:Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection kit
产品中文名称:Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒
规格:20T/50T/100T
货号:EY-01X8541
用途:仅供科研研究实验
特点&优势:
• 标准化,具有阳性对照。解决凋亡检测的非标准化问题
• 荧光强度和光稳定性更好;EGFP是FITC的替代物,荧光强度和光稳定性更好
• 适用于流式细胞术和荧光显微镜
保存建议:-20℃,避光保存12个月。
运输条件:蓝冰运输
背景
细胞凋亡(apoptosis)是一种基本生物学现象,指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。在正常活细胞中,磷脂酰(PS)位于细胞膜的内侧,而在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(Annexin V) 是一种分子量为35~36KDa的钙离子依赖型磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。通过荧光素或者标记Annexin V即可简单快速地直接检测出细胞早期凋亡情况。 碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的,对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此将Annexin V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。PI可以被488,532或546nm激光线激发,并发出红色荧光。
本产品具有下列特点:
1.操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时,无需洗涤或收获细胞,免去溶解步骤。
2. 无放射性。不需要配制液闪混合物,也不需要处理废弃物。
3. 与MTT相比,使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲臜产物。
4. 操作灵活,与MTT不同,平板读数后可放回温箱继续孵育,使颜色进一步生成。
操作步骤:
(一)获得目的基因
1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表达
1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。
5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
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