产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断
商品属性：

产品英文名称：Huamn RANKL protein

产品中文名称：重组人核因子κ B受体活化因子配体RANKL

规格：5 μg/20 μg/100 μg/1 mg

货号：EY-01X8674
用途：仅供科研研究实验

特点&优势:

标签:无标签

表达宿主:大肠杆菌

种属:人

序列:氨基酸序列来源于人源： RANKL (Ala142-Asp317)（O14788）表达的蛋白片段，C-末端带有 6×His 标记。

活性:通过其在 RAW264.7 细胞中诱导破骨细胞分化的能力来衡量。这种效应的ED50<10 ng/mL。

蛋白长度：该蛋白质的计算分子量为 20.67 kDa，在还原条件下，蛋白质迁移为 17 kDa（SDS-PAGE 分析）。

纯度:> 98 % ，使用SDS-PAGE检测

采用 LAL 法检测，每 1 μg 蛋白质中的动겸动

背景

NF-κB 受体激活剂（RANK）配体（RANKL）是 TNF 细胞因子超家族中的 II 型跨膜蛋白，其细胞外结构域位于 TNF 细胞因子超家族的羧基端。RANKL 是一种 19.8 kDa 的蛋白质，含有 317 个残基，在 T 细胞和 T 细胞丰富的器官（如胸腺和淋巴结）中高表达。RANKL-RANK（RANKL 受体）在骨代谢、失调和免疫系统中发挥着重要作用。

本产品具有下列特点:

 1.操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时,无需洗涤或收获细胞,免去溶解步骤。

2. 无放射性。不需要配制液闪混合物,也不需要处理废弃物。

3. 与MTT相比,使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲臜产物。

4. 操作灵活,与MTT不同,平板读数后可放回温箱继续孵育,使颜色进一步生成。

操作步骤：

(一)获得目的基因

1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体

1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三)  获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

(四)诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

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