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实时荧光定量PCR试剂盒的常见问题及解决策略
点击次数:158 更新时间:2024-06-25
  实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,简称qRT-PCR)技术,因其高灵敏度、高特异性和高定量准确性,已成为分子生物学研究中不可少的工具。然而,在实际使用过程中,实时荧光定量PCR试剂盒经常会遇到一些常见问题,影响了实验结果的准确性和可靠性。本文将对这些问题进行梳理,并提出相应的解决策略。
  一、常见问题
  1.无CT值(信号)出现
  无CT值出现是qRT-PCR实验中最为常见的问题之一。可能的原因包括:反应循环数不足、检测荧光信号的步骤有误、引物或探针降解、引物或探针设计不合理、模板量不足或模板降解等。
  2.CT值出现过晚
  CT值出现过晚通常意味着PCR扩增效率较低。可能的原因包括:扩增效率低、PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长、MgCl2浓度不合适、循环数设置不足、引物或探针设计有误等。
  3.标准曲线的线性关系不佳
  标准曲线的线性关系不佳通常意味着PCR反应中存在不稳定因素,影响了实验结果的定量准确性。可能的原因包括:加样存在误差、标准品出现降解等。
  二、解决策略
  1.针对无CT值出现的解决策略
  (1)确保反应循环数足够。一般而言,循环数应设置在35至45个之间,避免背景信号过高影响结果。
  (2)检查荧光信号检测步骤是否正确。根据试剂盒说明书或实验方法,确保在正确的PCR反应步骤中采集荧光信号。
  (3)通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解。若发现降解现象,应重新制备引物和探针。
  (4)优化引物和探针的设计。根据目的基因的特性,设计合适的引物和探针,避免引物跨越内含子或探针设计在扩增片段的5'端等可能导致扩增效率低的问题。
  (5)确保模板量足够且未降解。对于未知浓度的样品,应从系列稀释样本的最高浓度做起,避免模板量不足导致无CT值出现。同时,注意样品的储存条件,避免反复冻融导致模板降解。
  2.针对CT值出现过晚的解决策略
  (1)优化PCR反应条件。如适当降低退火温度、调整延伸时间等,以提高PCR扩增效率。
  (2)检查MgCl2浓度是否合适。按0.5mM的间距调整MgCl2的浓度,找到适合本实验条件的浓度。
  (3)重新设计引物和探针。若引物或探针设计不合理,可能导致扩增效率低,应重新设计并优化。
  (4)确保PCR产物长度合适。PCR产物长度一般应在80至150bp之间,过长或过短都可能影响扩增效率。
  3.针对标准曲线线性关系不佳的解决策略
  (1)确保加样准确。注意每次加样的一致性及移液器的校正,避免加样误差导致标准曲线线性关系不佳。
  (2)确保标准品质量稳定。避免标准品反复冻融或长时间储存导致降解,应重新制备并稀释标准品。
  实时荧光定量PCR试剂盒在使用过程中可能会遇到各种问题,但通过仔细排查原因并采取相应的解决策略,可以确保实验结果的准确性和可靠性。

 

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