BEL-7404人肝癌细胞实验操作步骤

细胞传代与扩增

当细胞密度达到80%-90%时即可传代。弃去旧培养基，用预冷的PBS轻柔洗涤2次，加入0.25%（含0.02% EDTA）1mL，37℃消化1-2分钟。镜下观察细胞回缩变圆后，立即加入2mL培养基终止消化，轻柔吹打形成单细胞悬液。1000rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬后按1:2~1:3比例分至新培养瓶，补充培养基至3mL/瓶，标记好代次与日期。

冻存与复苏

冻存液配制：培养基与DMSO按9:1比例混合，4℃预冷。取对数生长期细胞，按传代方法消化后计数，调整密度至5×10⁶/mL，与冻存液1:1混合分装至冻存管，标注细胞名称、代次、日期。采用梯度降温法：4℃ 30min→-20℃ 2h→-80℃过夜，最后转入液氮长期保存。复苏时快速将冻存管置入37℃水浴，融化后转移至15mL离心管，加5mL预温培养基稀释，离心去上清，重悬后接种至培养瓶。

实验质量控制

（1）定期检测支原体污染（每2月1次），推荐使用PCR法；

（2）传代时保留细胞形态照片，异常形态需排查污染或代谢问题；

（3）关键实验前需进行活力检测（台盼蓝染色法活细胞率应>95%）；

（4）建立细胞生长曲线，记录群体倍增时间（PDT），BEL-7404正常PDT为24±2小时。

注意事项

（1）所有操作需在超净台内完成，避免交叉污染；

（2）消化时间根据细胞状态动态调整，过度消化会导致细胞损伤；

（3）冻存细胞复苏后换液需保留50%原培养基；

（4）实验数据需记录培养基批号、血清来源等关键参数。

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