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如何使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验
点击次数:465 更新时间:2024-08-19
使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验是一个复杂但精确的过程,涉及多个关键步骤。以下是一个详细的实验流程,旨在指导如何正确使用该试剂盒进行RNA的检测和定量分析。
一、实验前准备
1.了解试剂盒信息:首先,仔细阅读试剂盒的说明书,了解试剂盒的组成、储存条件、有效期以及实验所需的设备和试剂。
2.实验设备和试剂准备:
-荧光定量PCR仪:确保仪器已经过校准,并熟悉其操作界面。
-微量移液器、离心机、涡旋振荡器、分光光度计等实验设备。
-无RNA酶的离心管、枪头、EP管等耗材。
-试剂包括RNA提取试剂(如RNAiso Plus)、氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC水配制)、反转录试剂、qPCR反应液等。
二、实验步骤
1.细胞总RNA提取
1.细胞裂解:对于贴壁细胞,弃去培养液后,用PBS清洗一次,加入适量RNA提取试剂(如RNAiso Plus),吹打均匀后室温静置5分钟。
2.两相分离:加入适量的氯仿(如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿),剧烈振荡后室温静置5分钟,然后4℃离心15分钟(12000G)。此时,混合物将分为三层,RNA主要在水相上层。
3.RNA沉淀:小心吸取上层水相转移至新的无RNA酶离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀后室温静置10分钟,再4℃离心10分钟(12000G)。此时,RNA将在管底部形成胶状沉淀。
4.RNA清洗:弃去上清,加入适量的75%乙醇(用DEPC水配制),轻轻上下颠倒混匀,4℃离心5分钟(7000rpm),重复清洗1-2次。
5.RNA干燥与溶解:小心吸去乙醇,室温干燥RNA沉淀5-10分钟,避免过分干燥。然后加入适量的无RNA酶水溶解RNA,保存于-80℃备用。
2.RNA浓度和纯度测定
使用分光光度计测定RNA溶液在260nm和280nm处的吸光度值,计算RNA的浓度和纯度(A260/A280比值应接近2.0)。
3.反转录合成cDNA
根据反转录试剂盒的说明书,将RNA反转录成cDNA。这通常涉及在RNA溶液中加入反转录酶、引物和其他必要组分,然后在适当的温度下孵育一段时间。
4.qPCR实验
1.配置qPCR反应液:按照试剂盒说明书,将qPCR反应液的各组分按比例混合,并加入适量的cDNA模板。
2.点板:将配置好的qPCR反应液加入96孔板或八联管中,注意避免气泡和液滴贴壁。
3.上机检测:将加好样的孔板或八联管放入荧光定量PCR仪中,设置合适的反应条件(如温度循环和荧光信号采集模式),开始实验。
4.数据分析:实验结束后,收集并分析荧光信号数据,根据标准曲线或CT值计算目标基因的相对表达量。
三、注意事项
1.避免污染:整个实验过程中应严格遵循无RNA酶操作原则,防止RNA降解和污染。
2.精确操作:在加样、离心等步骤中,应精确控制体积和时间,确保实验结果的可重复性。
3.设备校准:定期对荧光定量PCR仪等实验设备进行校准和维护,确保仪器的准确性和稳定性。
4.储存条件:试剂盒和试剂应储存在推荐的温度下(通常为2-8℃或-20℃),避免光照和反复冻融。
使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验需要严格遵循实验步骤和注意事项,以确保实验结果的准确性和可靠性。
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